An easy two-step purification method for human leucocyte myeloperoxidase
Yükleniyor...
Dosyalar
Tarih
2015
Dergi Başlığı
Dergi ISSN
Cilt Başlığı
Yayıncı
Walter De Gruyter Gmbh
Erişim Hakkı
info:eu-repo/semantics/closedAccess
Özet
Objective: The object of this study is to describe a simple, rapid and cost effective method for purification of human leucocyte myeloperoxidase from a single donor. Myelopeoxidase (MPO) was purified by a two step procedure consisting of concanavalin-A Sepharose 4B affinity chromatography followed by CM-Sephadex cation exchange chromatography. Methods: Leucocytes from a single donor collected by leucopheresis were used in purification studies. MPO was solubilized and extracted from leucocytes by homogenization in phosphate buffer containing 1% HETAB (hexadecyltrimethylammonium bromide). MPO containing soluble material was applied onto concanavalin-A Sepharose 4B affinity gel, and was eluted with methyl-a-D-manno-piranoside. Fractions with MPO activity were pooled, dialyzed and applied onto CM-sephadex cation exchange gel, and was eluted from the column at weak cationic pH with linear NaCl gradient. Results: By the use of two chromatographic procedures, MPO was purified from human leucocytes with 70% yield. Purity of MPO was checked by determining the Reinheit Zahl (RZ) value (A(430)/A(280)). The RZ value of 0.86 indicated that the purified enzyme was highly homogenous as compared to reported experimental values (ranging from 0.82 to 0.88) and pure commercial enzyme with the RZ value of 0.84. Conclusion: In comparison with earlier purification methods, the purification method reported here has higher recovery rate and high purity together. Use of leucocytes with leucopheresis origin help us to omit the leucocyte isolation step and omitting of ammonium sulphate precipitation steps also help us to reduce the cost and is shortened the time of purification.
Amaç: Bu çalışmanın amacı, tek vericiden temin edilen lökositlerden miyeloperoksidaz (MPO) enzimini saflaştırmak için basit, hızlı ve ekonomik bir yöntem geliştirmektir. Çalışmada, insan lökosit miyeloperoksidaz enziminin konkanavalin A-Sefaroz 4B afinite kromatografisi ile CM-Sefadeks katyon değiştirici kromatografisinden oluşan iki basamakta saflaştırılması sunulmuştur. Metod: Saflaştırma çalışmasında, lökoferez ile tek kişiden alınmış insan lökositleri kullanıldı. Lökosit miyeloperoksidazı, %1 oranında HETAB (hekzadesiltrimetilamonyum bromide) içeren fosfat tampon içinde çözünürleştirildi ve santrifügasyonla diğer zarsal fraksiyonlardan ayrıştırıldı. Çözünürleştirilen enzim konkanavalin A-Sefaroz afinite jeline uygulandı ve bağlanan enzim bu jelden metil-a-D-manno-piranozid ile indirildi. Kromatografide MPO aktivitesi içeren fraksiyonlar birleştirildi, diyaliz edildikten sonra CM-sefadeks katyon değiştirici kolona uygulandı. Enzim bu kolondan hafif bazik pH’daki fosfat tampon içinde lineer NaCl gradient ile indirildi. Bulgular: Uygulanan iki kromatografik yöntemle MPO enzimi insan lökositlerinden %70 verimle saflaştırıldı. Enzimin saflığı, Reinheit Zahl (RZ) değeri (A430/A280) ölçülerek control edildi. Reinheit Zahl değeri saflaştırılan MPO için 0.86 olarak hesaplandı. Bu RZ değeri, daha önce literatürde saf enzim için bildirilen değerler (0.82–0.88 arasında) ve saf ticari MPO için belirlenmiş değer (0.84) ile karşılaştırıldığında, bu saflaştırma çalışması ile elde edilen enzimin saflığını gösterir. Sonuç: Önceki saflaştırma metotlarıyla karşılaştırıldığında bu metot daha yüksek geri kazanım oranı ve saflık oranını birlikte sunmaktadır. Lökofrez kaynaklı lökosit kullanımı ve amoniyum sulfat basamağının çıkarılması maliyetin azalması ve zamanın kısalmasını sağlamıştır.
Amaç: Bu çalışmanın amacı, tek vericiden temin edilen lökositlerden miyeloperoksidaz (MPO) enzimini saflaştırmak için basit, hızlı ve ekonomik bir yöntem geliştirmektir. Çalışmada, insan lökosit miyeloperoksidaz enziminin konkanavalin A-Sefaroz 4B afinite kromatografisi ile CM-Sefadeks katyon değiştirici kromatografisinden oluşan iki basamakta saflaştırılması sunulmuştur. Metod: Saflaştırma çalışmasında, lökoferez ile tek kişiden alınmış insan lökositleri kullanıldı. Lökosit miyeloperoksidazı, %1 oranında HETAB (hekzadesiltrimetilamonyum bromide) içeren fosfat tampon içinde çözünürleştirildi ve santrifügasyonla diğer zarsal fraksiyonlardan ayrıştırıldı. Çözünürleştirilen enzim konkanavalin A-Sefaroz afinite jeline uygulandı ve bağlanan enzim bu jelden metil-a-D-manno-piranozid ile indirildi. Kromatografide MPO aktivitesi içeren fraksiyonlar birleştirildi, diyaliz edildikten sonra CM-sefadeks katyon değiştirici kolona uygulandı. Enzim bu kolondan hafif bazik pH’daki fosfat tampon içinde lineer NaCl gradient ile indirildi. Bulgular: Uygulanan iki kromatografik yöntemle MPO enzimi insan lökositlerinden %70 verimle saflaştırıldı. Enzimin saflığı, Reinheit Zahl (RZ) değeri (A430/A280) ölçülerek control edildi. Reinheit Zahl değeri saflaştırılan MPO için 0.86 olarak hesaplandı. Bu RZ değeri, daha önce literatürde saf enzim için bildirilen değerler (0.82–0.88 arasında) ve saf ticari MPO için belirlenmiş değer (0.84) ile karşılaştırıldığında, bu saflaştırma çalışması ile elde edilen enzimin saflığını gösterir. Sonuç: Önceki saflaştırma metotlarıyla karşılaştırıldığında bu metot daha yüksek geri kazanım oranı ve saflık oranını birlikte sunmaktadır. Lökofrez kaynaklı lökosit kullanımı ve amoniyum sulfat basamağının çıkarılması maliyetin azalması ve zamanın kısalmasını sağlamıştır.
Açıklama
Anahtar Kelimeler
Myeloperoxidase, Human Leucocytes, Purification
Kaynak
Turkish Journal Of Biochemistry-Turk Biyokimya Dergisi
WoS Q Değeri
Q4
Scopus Q Değeri
Q4
Cilt
40
Sayı
5
