Replacement of the Glu380 with Gln380 in subunit I of cytochrome cbb(3) oxidase from Rhodobacter capsulatus results in inactive enzyme

Basit Öğe Kaydı
dc.authorid0000-0002-4095-6619en_US
dc.contributor.authorÖztürk, Mehmet
dc.contributor.authorEr, Şükrüye
dc.contributor.authorYıldız, Gülgez Gökçe
dc.date.accessioned2021-06-23T19:33:58Z
dc.date.available2021-06-23T19:33:58Z
dc.date.issued2012
dc.departmentBAİBÜ, Fen Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümüen_US
dc.description.abstractObjective: To show the importance of conserved glutamate 380 residue located in the helix IX of catalytic subunit of the cbb(3)-type oxidases from Rhodobacter capsulatus by site-directed mutagenesis. Method: E380Q mutant was generated by site-directed mutagenesis using pMOZI vector as a template. After verification of the desired mutation and a few subcloning processes, pOX15/E380Q plasmid was transferred to GK32 strain of R. capsulatus by triparental mating. To determine the effect of the mutation on assembly of the cbb(3)-type oxidase the chromatophore vesicles were separated by PAGE and than samples were analyzed with TMBZ staining and western blotting. The enzyme activity was determined by NADI staining of whole cells and spectroscopic measurement of the oxygen consumption rate of chromotophore vesicle. Results: The sequencing results showed that E380Q mutation was created successfully during PCR reactions. Western blot analysis and TMBZ staining of the PAGE gel revealed that mutated cbb(3)-type oxidase lacked all subunits of the enzyme. The E380Q mutant led to complete loss of activity of cbb(3)-type oxidase which was observed by NADI test and oxygen consumption rate measurement (1%). Conclusion: Our findings support the assumption that emphasizes the fact that the active site structure can be very different in the subfamilies of the heme-copper oxidases, and well conserved within individual subfamilies.en_US
dc.description.abstractAmaç: Rhodobacter capsulatus’a ait cbb3 -tipi oksidaz enziminin katalitik alt ünitesinin IX. sarmalında korunmuş olarak bulunan glutamat 380 aminoasidinin yönlendirilmiş mutagenez yöntemi ile öneminin gösterilmesi. Metot: pMOZI vektörü kalıp olarak kullanılarak yönlendirilmiş mutagenez ile E380Q mutantı elde edilmiştir. İstenilen mutasyonun gerçekleştiği doğrulandıktan ve birkaç alt klonlamadan sonra pOX15/E380Q plazmidi R. capsulatus’un GK32 suşuna üçlü eşleşme ile aktarılmıştır. Mutasyonun cbb3 -tipi oksidazın alt ünitelerinin birleşmesi üzerine olan etkisini belirlemek için kromatofor zar proteinleri SDS-PAGE ile ayrıştırılmış, TMBZ boyama ve western blotlama ile analiz edilmiştir. Enzim aktivitesi, hücrelerin NADI boyanması ve kromatofor zar proteinlerinin spektrofotometrik ölçümle oksijen kullanım oranlarının hesaplanması ile belirlenmiştir. Bulgular: Dizi analizi sonuçları E380Q mutasyonun PZR reaksiyonunda istenilen şekilde gerçekleştiğini göstermiştir. Western blot analizi ve SDS-PAGE jelinin TMBZ boyaması, mutant cbb3 -tipi oksidaz enziminin alt ünitelerinin eksik olduğunu göstermiştir. E380Q mutasyonun, NADI testi ve oksijen kullanım ölçümleri (%1) sonucunda enzim aktivitesinin tamamen kaybına neden olduğu belirlenmiştir. Sonuç: Elde edilen bulgular, demir bakır oksidazların aktif bölge yapılarının alt gruplarında farklılık gösterebileceği ve her bir alt grup içerisindeki bireylerde korunmuş olabileceği varsayımını desteklemektedir.
dc.identifier.doi10.5505/tjb.2012.25743
dc.identifier.endpage53en_US
dc.identifier.issn0250-4685
dc.identifier.issn1303-829X
dc.identifier.issue1en_US
dc.identifier.scopus2-s2.0-84859447648en_US
dc.identifier.scopusqualityQ4en_US
dc.identifier.startpage48en_US
dc.identifier.urihttps://doi.org/10.5505/tjb.2012.25743
dc.identifier.urihttps://hdl.handle.net/20.500.12491/7313
dc.identifier.volume37en_US
dc.identifier.wosWOS:000307443500008en_US
dc.identifier.wosqualityQ4en_US
dc.indekslendigikaynakWeb of Scienceen_US
dc.indekslendigikaynakScopusen_US
dc.institutionauthorÖztürk, Mehmet
dc.institutionauthorYıldız, Gülgez Gökçe
dc.institutionauthorEr, Şükrüye
dc.language.isoenen_US
dc.publisherWalter De Gruyter Gmbhen_US
dc.relation.ispartofTurkish Journal Of Biochemistryen_US
dc.relation.ispartofTürk Biyokimya Dergisi
dc.relation.publicationcategoryMakale - Uluslararası Hakemli Dergi - Kurum Öğretim Elemanıen_US
dc.rightsinfo:eu-repo/semantics/closedAccessen_US
dc.subjectCytochrome cbb(3)-type Oxidaseen_US
dc.subjectD-proton Pumping Channelen_US
dc.subjectSite Directed Mutagenesis and Rhodobacter Capsulatusen_US
dc.subjectSitokrom cbb3-tipi Oksidaz
dc.subjectD- proton Pompalama Kanalı
dc.subjectYönlendirilmiş Mutagenez ve Rhodobacter Capsulatus
dc.titleReplacement of the Glu380 with Gln380 in subunit I of cytochrome cbb(3) oxidase from Rhodobacter capsulatus results in inactive enzymeen_US
dc.typeArticleen_US

Dosyalar

Orijinal paket
Listeleniyor 1 - 1 / 1
Küçük Resim Yok
İsim:
mehmet-ozturk.pdf
Boyut:
666.35 KB
Biçim:
Adobe Portable Document Format
Açıklama:
Tam metin/Full text
İndir

Koleksiyon

WoS İndeksli Yayınlar Koleksiyonu
Biyoloji Bölümü Koleksiyonu
Scopus İndeksli Yayınlar Koleksiyonu