Replacement of the Glu380 with Gln380 in subunit I of cytochrome cbb(3) oxidase from Rhodobacter capsulatus results in inactive enzyme
Yükleniyor...
Dosyalar
Tarih
2012
Dergi Başlığı
Dergi ISSN
Cilt Başlığı
Yayıncı
Walter De Gruyter Gmbh
Erişim Hakkı
info:eu-repo/semantics/closedAccess
Özet
Objective: To show the importance of conserved glutamate 380 residue located in the helix IX of catalytic subunit of the cbb(3)-type oxidases from Rhodobacter capsulatus by site-directed mutagenesis. Method: E380Q mutant was generated by site-directed mutagenesis using pMOZI vector as a template. After verification of the desired mutation and a few subcloning processes, pOX15/E380Q plasmid was transferred to GK32 strain of R. capsulatus by triparental mating. To determine the effect of the mutation on assembly of the cbb(3)-type oxidase the chromatophore vesicles were separated by PAGE and than samples were analyzed with TMBZ staining and western blotting. The enzyme activity was determined by NADI staining of whole cells and spectroscopic measurement of the oxygen consumption rate of chromotophore vesicle. Results: The sequencing results showed that E380Q mutation was created successfully during PCR reactions. Western blot analysis and TMBZ staining of the PAGE gel revealed that mutated cbb(3)-type oxidase lacked all subunits of the enzyme. The E380Q mutant led to complete loss of activity of cbb(3)-type oxidase which was observed by NADI test and oxygen consumption rate measurement (1%). Conclusion: Our findings support the assumption that emphasizes the fact that the active site structure can be very different in the subfamilies of the heme-copper oxidases, and well conserved within individual subfamilies.
Amaç: Rhodobacter capsulatus’a ait cbb3 -tipi oksidaz enziminin katalitik alt ünitesinin IX. sarmalında korunmuş olarak bulunan glutamat 380 aminoasidinin yönlendirilmiş mutagenez yöntemi ile öneminin gösterilmesi. Metot: pMOZI vektörü kalıp olarak kullanılarak yönlendirilmiş mutagenez ile E380Q mutantı elde edilmiştir. İstenilen mutasyonun gerçekleştiği doğrulandıktan ve birkaç alt klonlamadan sonra pOX15/E380Q plazmidi R. capsulatus’un GK32 suşuna üçlü eşleşme ile aktarılmıştır. Mutasyonun cbb3 -tipi oksidazın alt ünitelerinin birleşmesi üzerine olan etkisini belirlemek için kromatofor zar proteinleri SDS-PAGE ile ayrıştırılmış, TMBZ boyama ve western blotlama ile analiz edilmiştir. Enzim aktivitesi, hücrelerin NADI boyanması ve kromatofor zar proteinlerinin spektrofotometrik ölçümle oksijen kullanım oranlarının hesaplanması ile belirlenmiştir. Bulgular: Dizi analizi sonuçları E380Q mutasyonun PZR reaksiyonunda istenilen şekilde gerçekleştiğini göstermiştir. Western blot analizi ve SDS-PAGE jelinin TMBZ boyaması, mutant cbb3 -tipi oksidaz enziminin alt ünitelerinin eksik olduğunu göstermiştir. E380Q mutasyonun, NADI testi ve oksijen kullanım ölçümleri (%1) sonucunda enzim aktivitesinin tamamen kaybına neden olduğu belirlenmiştir. Sonuç: Elde edilen bulgular, demir bakır oksidazların aktif bölge yapılarının alt gruplarında farklılık gösterebileceği ve her bir alt grup içerisindeki bireylerde korunmuş olabileceği varsayımını desteklemektedir.
Amaç: Rhodobacter capsulatus’a ait cbb3 -tipi oksidaz enziminin katalitik alt ünitesinin IX. sarmalında korunmuş olarak bulunan glutamat 380 aminoasidinin yönlendirilmiş mutagenez yöntemi ile öneminin gösterilmesi. Metot: pMOZI vektörü kalıp olarak kullanılarak yönlendirilmiş mutagenez ile E380Q mutantı elde edilmiştir. İstenilen mutasyonun gerçekleştiği doğrulandıktan ve birkaç alt klonlamadan sonra pOX15/E380Q plazmidi R. capsulatus’un GK32 suşuna üçlü eşleşme ile aktarılmıştır. Mutasyonun cbb3 -tipi oksidazın alt ünitelerinin birleşmesi üzerine olan etkisini belirlemek için kromatofor zar proteinleri SDS-PAGE ile ayrıştırılmış, TMBZ boyama ve western blotlama ile analiz edilmiştir. Enzim aktivitesi, hücrelerin NADI boyanması ve kromatofor zar proteinlerinin spektrofotometrik ölçümle oksijen kullanım oranlarının hesaplanması ile belirlenmiştir. Bulgular: Dizi analizi sonuçları E380Q mutasyonun PZR reaksiyonunda istenilen şekilde gerçekleştiğini göstermiştir. Western blot analizi ve SDS-PAGE jelinin TMBZ boyaması, mutant cbb3 -tipi oksidaz enziminin alt ünitelerinin eksik olduğunu göstermiştir. E380Q mutasyonun, NADI testi ve oksijen kullanım ölçümleri (%1) sonucunda enzim aktivitesinin tamamen kaybına neden olduğu belirlenmiştir. Sonuç: Elde edilen bulgular, demir bakır oksidazların aktif bölge yapılarının alt gruplarında farklılık gösterebileceği ve her bir alt grup içerisindeki bireylerde korunmuş olabileceği varsayımını desteklemektedir.
Açıklama
Anahtar Kelimeler
Cytochrome cbb(3)-type Oxidase, D-proton Pumping Channel, Site Directed Mutagenesis and Rhodobacter Capsulatus, Sitokrom cbb3-tipi Oksidaz, D- proton Pompalama Kanalı, Yönlendirilmiş Mutagenez ve Rhodobacter Capsulatus
Kaynak
Turkish Journal Of Biochemistry
Türk Biyokimya Dergisi
Türk Biyokimya Dergisi
WoS Q Değeri
Q4
Scopus Q Değeri
Q4
Cilt
37
Sayı
1
