The effects of replacement of five highly conservedaminoacids of subunit-i in cbb3-type oxidase ofrhodobacter capsulatus

Demir-bakır oksidazlar, oksijeni suya indirgeyen, hücre zarına gömülü vezar boyunca proton pompalayan solunum zincirinin son elemanlarıdır. Farklıtürdeki Demir-bakır oksidazların I. alt ünitelerine ait amino asit dizilerieslestirildiginde, R. capsulatus ta bulunan cbb3 oksidaz'a ait serine 333 (S333),serine 340 (S340), threonine 350 (T350), asparagine 390 (N390) ve threonine 396(T396) amino asitlerinin, korunmus oldugu görülmüstür. Bu çalısmada, R.capsulatus'a ait cbb3 tipi oksidazda korunmus olan bu amino asitlerin, enzimininyapı ve islevine etkileri arastırılmıstır.Bu amaçla, cbb3 oksidazın ccoNOQP yapısal genini tasıyan rekombinantpOX15 DNA'sının 2.8 kbp'lik parçası pBluescript vektörüne klonlanmıs ve eldeedilen pMOZI klonu kullanılarak hedeflenen amino asitler yönlendirilmis in vitromutagenez ile alanine dönüstürülmüstür. Mutasyonlar DNA dizi analizi iledogrulandıktan sonra, korunmus amino asitler den birisini tasıyan her bir plazmid,R. capsulatus'un GK32 susuna aktarılmıstır. Elde edilen mutantların enzimaktivitesine etkileri NADI boyama ile gözlemlenirken, mutasyonların enzimüzerindeki yapısal etkileri kromatofor zar proteinlerinin Schägger-tipipolyakrilamid jel de ayrıstırılması ve jelin 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin (TMBZ) ileboyanmıs ile tespit edilmistir.Serin ve tironin mutantları (S340A, T350A ve T396A) yaban tip ile aynıaktiviteye sahipken, serin 333 mutasyonu (S333A) enzim aktivitesini azaltmıs,asparajin mutasyonu (N390A) ise enzim aktivitesini tamamen yok etmistir.Mutantların hücre zarı proteinlerindeki sitokrom c profilleri incelendiginde, S333A,S340A, T350A ve T396A mutantları yaban tip ile aynı profilleri vermis, ancakN390A mutantında sitokrom cbb3 oksidazın cp alt ünitesine rastlanmamıs ve co altünitesinin de azaldıgı görülmüstür. Arastırma sonuçları, serine 333 ve asparagine390 amino asitlerinin R. capsulatustaki cbb3 tipi sitokrom oksidazın aktivitesi yadayapısı üzerinde kritik öneme sahip oldugunu göstermistir.Anahtar kelimeler: Rhodobacter capsulatus, solunum, cbb3 tipi sitokrom coksidaz aktivitesi, yönlendirilmis mutagenez, kromatofor zar proteini izolasyonu,

The heme-copper oxidases are the terminal elements of the membraneboundrespiratory chains that catalyze the reduction of molecular oxygen to waterand pump protons across the membrane. Analysis of the amino acid sequencesalignment of subunit I from different families of heme-copper oxidases showedthat some of the amino acids, serine 333 (S333), serine 340 (S340), threonine 350(T350), asparagine 390 (N390) and threonine 396 (T396) (R. capsulatusnumbering) are almost strictly conserved. This work was undertaken to determinethe relationships between these amino acids and the activity and assembly of thecbb3 oxidase in R. capsulatus.For this aim, 2.8 kbp fragment of the previously cloned pOX15, containingstructural gene (ccoNOQP) of cytochrome cbb3 oxidase of R. capsulatus, wassubcloned into pBluescript vector. The new clone, pMOZI, was used to substituteconserved amino acids for alanine by site-directed in vitro mutagenesis and theintegrity of each of these mutations was checked by sequencing. The mutatedplasmids each of which carries one of the desired substitutions on structural geneof the cbb3 oxidase were transferred into R. capsulatus strain, GK32. While theeffects of the mutations on cytochrome c oxidase activity were evaluated byNADI plate assays, the structural integrity of the mutant oxidases weredetermined by separation of chromatophore membrane proteins on Schägger-typepoly acrylamide gel stained with 3,3?,5,5?-tetramethylbenzidine (TMBZ).While serine and threonine mutants (S340A, T350A and T396A) had thesame activity with wild-type, serine 333 mutation (S333A) decreased the enzymeactivity and asparagine mutation (N390A) led to a complete loss of the cbb3oxidase activity. When cytochrome c profiles of mutants were examined, it wasfound that cytochrome cbb3 profiles of S333A, S340A, T350A and T396Amutants were the same to that of the wild-type, however the cp subunit of cbb3oxidase was missing and the amount of the co subunit was decreased in N390Amutant. The results indicated that S333 and N390 are very critical residues foractivity or assembly of the cbb3-type cytochrome oxidase in R. capsulatus.Keywords: Rhodobacter capsulatus, respiration, cytochrome cbb3-type oxidaseactivity, site-directed mutagenesis, chromatophore membrane protein isolation,