Öztürk, Mehmet2024-09-252024-09-252016https://search.trdizin.gov.tr/tr/yayin/detay/617607https://hdl.handle.net/20.500.12491/1471501.05.2016Safra tuzu hidrolazlar (BSH), sindirim sistemi bakterileri olan özellikle Lactobacillus ve Bifidobacterium, gibi organizmalarda glisin ya da taurin ile konjüge olmuş safra tuzlarının aminoasitlere ve safra asitlerine indirgenmesini sağlamaktadır. Probiyotiklerin ağızdan uygulamaları ile kolesterol seviyesinin %22-33 oranında azalttığı insan, fare, rat ve domuzlarda gösterilmiştir. Diğer taraftan bağırsaktaki bakteriler tarafından salgılanan BSH’ın bağırsakta oluşturduğu dioksikolik asit ve litokolik asit gibi sekonder metabolitler toksik olmaları nedeni ile hücrede DNA hasarı oluşturarak yâda apoptozis’i indükleyerek kolon kanserine neden olduklarını gösteren son yıllarda yapılmış çok sayıda çalışma mevcuttur. BSH ve toksik sekonder metabolitler arasındaki ilişkiyi ortaya koymak için BSH enzimin yapı ve fonksiyonunun daha iyi anlaşılması gerekmektedir. Bu çalışmada, BSH enziminin yapı ve çalışma mekanizmasını daha iyi anlayabilmek için insan kaynaklı, yüksek BSH aktivitesine sahip yerel Lactobacillus (Lb) plantarum suş’u kullanılmıştır. Bu amaçla gen bankasından türe özgü BSH geni nükleotid dizileri kullanılarak ileri ve geri primerlerin tasarımları yapılarak Lb. plantarum suşudan PZR ile yaklaşık 1,0 kb büyüklüğünde bsh geni çoğaltılmıştır. Çoğaltılan bsh geni pBluescript vektörüne klonlandıktan sonra BSH aktivitesine sahip klonlardaki bsh geni nükleotid dizileri belirlenerek Gen Bankasındaki bilinen bsh genleri ile karşılaştırılmıştır. Son olarak BSH enzimin karakteristik özelliklerini daha iyi anlayabilmek için, bsh geni pET22b ekspresyon vektörüne klonlanarak BSH aktivitesi direk besi yeri ve ninhidrin metodu ile belirlenmiştir. Araştırmanın ikinci bölümünde, katalitik aktiviteden sorumlu olduğu varsayılan Arg-16, Asp-19, Ans-170 ve Arg-223 aminoasitleri sırası ile Phe-16, Leu-19, Val-170 ve Phe223 aminoasitleri kodlayan kodonlara dönüştürülmüştür. Substrat özgüllüğünden sorumlu olduğu varsayılan Phe-18, Tyr-24, Asn-79, Leu-138 ve Asn-180 aminoasitlerini kodlayan kodonlar ise yönlendirilmiş mutasyonla sırası ile Leu-18, Phe-24, Val-79, Glu-138 ve His-180 aminoasitleri kodlayan kodonlara dönüştürülmüştür. Elde edilen mutant enzimler direk besi yeri testi ve ninhidrin metodu ile nitel olarak test edilmiştir. Ninhidrin test sonuçları direk besi yeri test sonuçlarına paralel olarak R16F, D19L, N170V ve R223F mutantlarının enzimin her iki tuza karşı olan aktivitelerini hemen hemen tamamen kaybettikleri gözlenmiştir. Mutant BSH enzimleri safra salgısında bulunan altı farklı safra tuzu (glikokolik asit, glikodioksikolik asit, glikokenodioksikolik asit, taurokolik asit, taurodioksikolik asit ve taurokenedioksikolik asit) ile muamele edilerek mutasyonların enziminin katalitik aktivitelerine ve substrat özgüllüklerine olan etkileri araştırılmıştır. Ninhidrin test sonuçları, R16, D19, N170 ve R223 aminoasitlerinin BSH enziminin aktivitesi için kritik olduğunu göstermiştir. SDSPAGE sonuçları ise D19, N170 ve R223 aminoasitlerinin BSH enziminin stabilitesinde kritik öneme sahip olduğunu gösterirken, R16 aminoasidinin BSH enziminin katalitik aktivitesi için önemli olduğunu göstermektedir. Diğer taraftan BSH enziminin substrat özgüllüğünden sorumlu olduğu varsayılan aminoasitler üzerinde yapılan mutasyon çalışmaları ise, F18, Y24, N79, L138 ve N180 aminoasitlerinin substrat tanımada etkin bir role sahip olduğunu ortaya koymaktadır. BSH enziminin farklı safra tuzlarını tanımasında özellikle F18, N79 ve N180 aminoasitlerinin etkili olduğu gösterilmiştir. Elde edilen sonuçlar, BSH enziminin substrat tanımada birden fazla aminoasidin etkin olduğu daha karmaşık bir mekanizmaya sahip olduğunu göstermektedir. Bu nedenle gelecekte bsh geninde substrat tanımada etkili olan aminoasitleri kodlayan kodonlar üzerinde aynı anda birden fazla mutasyonun yapılmasına ihtiyaç duyulmaktadır.trinfo:eu-repo/semantics/openAccessSubstrat özgüllüğüyönlendirilmiş mutagenezsafra tuzu hidrolaz enzimi (BSH)LactobacillusProject168617607