Safra Tuzu Hidrolaz Enziminin Substrat Özgüllüğünün Araştırılması

Proje, öncelikli olarak safra tuzu hidrolaz geni (sth) taşıyan pCON1 konstraktı kullanılarak substrat tanımadan sorumlu olduğu varsayılan aminoasitleri kodlayan kodonların yönlendirilmiş mutagenez yöntemi ile farklı özellikte aminoasitleri kodlayan kodonlara dönüştürülmesini ve daha sonra da, elde edilen mutasyonların enzimin substrat özgüllüğüne olan etkilerinin analiz edilmesini amaçlamaktadır.Safra Tuzu (ST) temel olarak karaciğerde glisin ve taurin aminoasitlerinin konjugasyonu ile kolesterolden sentezlenmekte ve safra kesesinde depolanmaktadır. Safra kesesinde altı farklı ST bulunmakta ve beslenme tarzına göre safra içeriğindeki tuz oranları değişmektedir. Örneğin fazla miktarda kırmız et tüketiminde taurin ile konjuge safta tuzları oranları artmaktadır. Bağırsağa salgılanan ST’nın hemen hemen %95’i incebağırsakta emilerek tekrar döngüye katılırken kalan %5’i kolona girmektedir. Barsak florası bakterilerindeki safra tuzu hidrolaz (STH) enzimi kolondaki glisin ya da taurine ile konjuge olmuş ST’larını glisin/taurin ve dekonjuge tuzlara katalizlemektedir. Dekonjuge safra tuzları çözünür olmadığı için gayta ile atıldığından eksilen tuzlar kandaki kolesterolden sentezlendiği için, STH enzimi dolaylı olarak serumdaki kolesterol seviyesini düşürmektedir. Bununla birlikte, bazı sindirim sistemi bakterileri dekonjuge tuzlardan dioksikolik asit (DCA) ve litokolik asit (LA) gibi toksik olan sekonder safra tuzlarını üretmektedirler. Kolonda ve kanda toksik olan sekonder safra tuzlarının birikmesi, safra taşları oluşumunu, kolon kanseri ve diğer gastrointestinal hastalık riskini artırmaktadır. Bu nedenle insan sağlığı açısından hem pozitif hem de negatif yönde ilişkisi bulunan STH enziminin karakterize edilmesi önem arz etmektedir. Literatürde birçok farklı bakteri türleri ve hatta suşlarından sth genleri klonlanarak karakterize edilmiştir. Ancak karakterize edilen STH’ların safra tuzlarına göstermiş oldukları özgüllük farklılık arz etmektedir. STH enziminin kristal yapısı bilinmesine rağmen, kristal yapılardaki substrat tanıma bölgeleri çok düşük düzeyde korunmuş olduğu için STH enziminin substrat özgüllüğünü belirleyen aminoasitlerin, kristal yapı ya da üç boyutlu modellemeler ile doğrudan tanımlanması çok zordur. Bu durum ancak substrat özgüllüğünden sorumlu olabileceği varsayılan aminoasitler üzerinde yönlendirilmiş mutagenez ile belirlenebilir. Bu konuda yönlendirilmiş mutagenez çalışmalarının önemi birçok araştırma ve derleme makalelerde vurgulanmasına rağmen, literatürde bununla ilgili hiçbir çalışma bulunmamaktadır. Bu çalışmada, pCON1 konstraktı kullanılarak yönlendirilmiş mutagenez yöntemi ile Val58, Tyr-65, Phe-129 ve Leu-133 aminoasitleri sırası ile 58-Asn, 65-Cys, 129-Ile ve 133-Phe mutantlarına dönüştürülmüştür. Hedeflenen mutasyonlar dizi analizi ile doğrulandıktan sonra, mutant STH genleri ekspresyon vektörü olan pET22b ‘ye klonlanarak E. coli BLR(DE)3 suşunda ifadesi gerçekleştirilmiştir. IPTG ile indüklenerek ekpresyonu artırılan mutant STH‘lar kısmi olarak saflaştırılmış ve sonra da mutasyonların STH enzimlerinin stabilitelerine ve altı farklı safra tuzuna karşı olan özgünlüklerine olan etkileri sırası ile SDS-PAGE ve ninhidrin yöntemi ile belirlenmiştir. Mutant STH enzimlerinin ninhidrin sonuçları değerlendirildiğinde, özellikle Tyr65 ve Phe129 ve Leu133 aminoasitlerinin katalitik aktivitelerini ve substrat seçimlerini etkiledikleri görülmüştür. Bu durum hedef olarak seçilen bu aminoasitlerin kısmen de olsa enzimin substrat tanımasında etkili olabileceğini göstermektedir. Buna karşın Val58, mutant BSH enziminin altı substrata karşı olan özgüllüklerinin değişim oranlarının yaban tip BSH enzimi ile aynı olması VAL58 aminoasidinin substrat özgüllüğünden ziyade enzimin katalitik aktivitesinden sorumlu olabileceğini göstermektedir. Diğer taraftan mutant enzimlerin SDS-PAGE sonuçları ise hedef aminoasitlerin enzimin katlanma ve stabilitesi için kritik aminoasitler olamadığını ortaya koymuştur. Elde edilen sonuçlar kısmi olarak korunmuş hedef aminoasitlerin STH'ların enzimsubstrat etkileşimlerinin konfigürasyonu için kritik bir role sahip olabileceğini, ayrıca, STH enziminin substrat tanımada birden fazla aminoasidin etkin olduğu daha karmaşık bir mekanizmaya sahip olduğuna işaret etmektedir. Bu nedenle STH enziminin substrat tanıma mekanizmasın daha iyi aydınlatmak için aynı anda birden fazla aminoasidin mutasyonun yapılmasına ihtiyaç olduğunu göstermektedir.