Characterization of cytochrome P450 mediated aldrin epoxidation in mullet liver microsomes
Tarih
Yazarlar
Dergi Başlığı
Dergi ISSN
Cilt Başlığı
Yayıncı
Erişim Hakkı
Özet
Organoklorlu bileşikler (OCP'ler) yağda çözünür moleküllerdir ve canlı organizmalarda birikme eğilimindedirler. Karadeniz'de OCP'lerin düzeyinin ölçüldüğü çalışmalar sınırlıdır. Bu çalışmamızda Batı Karadeniz Bölgesi'nde beş farklı lokasyondan has kefal balıkları (Mugil cephalus) 2009 yılında yakalanmıştır. Dokudan izolasyon işlemlerinden sonra, 16 farklı OCP'nin düzeyleri gaz kromatografisi ve elektron yakalama dedektörü ile ölçülmüştür. Bütün bölgelerde OCP tipi kirleticiler bulunmuştur. Bu sonuçlar bize Batı Karadeniz Bölgesi'nde OCP tipi kirleticilerin var olduğunu ve canlıların bu kimyasallara maruz kaldığını göstermiştir. Kimyasalların canlılarda birikmesi, kimyasalların biyotransformasyon reaksiyonlarına katılan enzimlere ve reaksiyona katılma düzeylerine bağlıdır. Bu çalışmamızda, aldrin'nin toksik olan metaboliti dieldrin'e dönüştürülmesi kefal karaciğer mikrozomunda çalışılmıştır. Kefal karaciğer dokularından mikrozomlar hazırlanmıştır. Mikrozomlarda aldrin epoksidaz aktivitesi, oluşan dieldrin miktarınıngaz kromotografisi ve elektron yakalama dedektörü ile ölçülmesiyle belirlenmiştir. En yüksek aldrin epoksidaz aktivitesi pH 7.6'da ve 5 mg protein konsantrasyonunda 0.5 mL reaksiyon ortamında elde edilmiştir. Aldrin epoksidaz enzimi monofazik reaksiyon kinetiği göstermiş ve Km değeri aldrin için 140 µM hesaplanmıştır. Aldrin epoksidaz aktivitesi Türkiye'nin Batı Karadeniz Bölgesi'nde beş farklı lokasyondan yakalanan balık örneklerinde optimum şartlarda ölçülmüştür. En düşük aldrin epoksidaz aktivitesi Amasra'dan yakalanan balıklarda ölçülmüştür. Zonguldak Limanı, Sakarya Nehir Ağzı ve Gülüç Irmağı Ağzı'ndan yakalanan kefal balıklarında Amasra'dan 2 kat daha fazla aldrin epoksidaz aktivitesi ölçülmüştür. Ayrıca, aldrin epoksidaz enzim aktivitesine katkısı olan spesifik sitokrom P450 enzim(leri), spesifik substrat ve inhibitörler kullanılarak belirlenmiştir. Aldrin epoksidaz aktivitesi ketokonazol (CYP3A inhibitörü), SKF-525A (CYP3A ve CYP2B inhibitörü) ve simetidin (CYP3A, CYP2C, CYP2D ve CYP1A inhibitörü) ile inhibe olurken, alfa naftoflavon (CYP1A inhibitörü), tolbutamit (CYP2C substratı), diklofenak (CYP2C substratı), orfenadrin (CYP2B6 inhibitörü) ve anilin (CYP2E substratı) ile inhibe olmamıştır. Bu sonuçlar bize CYP3A'nın aldrin epoksidaz aktivitesinde rolü bulunurken, CYP1A, CYP2C, CYP2D, CYP2B ve CYP2E'nin aldrin epoksidaz aktivitesinde rolünün olmadığını göstermiştir. Son olarak aldrin epoksidaz aktivitesi üzerine Cu+2, Cr+3, Ni+2, Tl+3, Co+3, Mg+2 ve Mn+2 metallerinin etkisine bakılmıştır. Aldrin epoksidaz aktivitesi üzerinde bakır, talyum, nikel ve krom sırasıyla %95, %22, %15 ve %13 inhibisyona sebep olmuştur.
Organochlorine pesticides (OCPs) are lipid soluble chemicals and tend to accumulate in living organisms. The studies concerning the OCP measurements in living organisms are limited in the Black Sea. In this study, flathead mullet samples (Mugil cephalus) were caught from five different locations of the West Black Sea Region of Turkey in 2009. Organochlorine pesticides were extracted from the liver tissues and then the levels of OCPs were measured by using gas chromatography and electron capture detector. Organochlorine pesticides were detected in all locations. This result clearly indicated the presence of OCPs in the West Black Sea region of Turkey and exposure of living organisms to these chemicals. Bioaccumulation of chemicals in living organisms depends on the relative amounts and activities of the different biotransformation enzymes. In the present study, the metabolism of aldrin to its toxic metabolite dieldrin was studied in mullet liver microsomes. Fish liver microsomes were prepared by differential centrifugation. Aldrin epoxidase activitywas determined by measuring the amount of dieldrin produced using gas chromatography and electron capture detector in the liver microsomes. Maximal fish liver aldrin epoxidase activity was observed at pH 7.6 and protein concentration of 5 mg in 0.5 mL reaction mixture. Aldrin epoxidase exhibited monophasic kinetics with apparent Km value of 140 ?M for aldrin. Aldrin epoxidase activities of the samples caught from five different locations of the West Black Sea Region of Turkey were measured at the optimum conditions. The lowest aldrin epoxidase activity was measured in the mullets caught from Amasra. Mullets caught from Zonguldak Harbour, Sakarya River and Gülüç Stream Mouths displayed 2 fold higher aldrin epoxidase activities than Amasra. In addition, the contribution of cytochrome P450 isozyme(s) was determined by using specific cytochrome P450 inhibitors and substrates. Ketoconazole (CYP3A inhibitor), SKF-525A (CYP3A and CYP2B inhibitors) and cimetidine (CYP3A, CYP2C, CYP2D and CYP1A inhibitors) potentially inhibited the metabolism of aldrin, alpha-naphthoflavone (CYP1A inhibitor), tolbutamide (CYP2C substrate), diclofenac (CYP2C inhibitor), orfenadrine (CYP2B6 inhibitor), quinidine (CYP2D inhibitor) and aniline (CYP2E substrate) did not show inhibition. The results of this study suggest that CYP3A is the cytochrome P450 isozyme involved in aldrin epoxidation in mullet liver microsomes whereas CYP1A, CYP2C, CYP2D, CYP2B and CYP2E are not involved. Finally, the effects of Cu2+, Cr3+, Ni2+, Tl3+, Co3+, Mg2+ and Mn2+ on aldrin epoxidase activity were determined. Copper, thallium, nickel and chromium caused 95%, 22%, 15% and 13% inhibition on aldrin epoxidase activity, respectively.