In vitro propagation and cardiac glycoside production in endemic Digitalis L. species of anatolia

Digitalis L. türleri içeriğindeki kalp glikozitlerinin kalp kası kasılma ve kalp ritmini düzenlemesinden ötürü tıbbi ve ekonomik değeri yüksek olan bitkilerdir. Bu çalışmada birçok doku kültürü uygulaması çoklu sürgün üretme maksadıyla farklı besi ortamları, büyüme düzenleyicileri ve in vitro koşullarda çimlendirilen fidelerden izole edilen çeşitli eksplantlar ile yapılmıştır. Sürgün rejenerasyonu, farklı besi ortamları arasından 0.5 mg/L thidiazuron (TDZ) ve 0.25 mg/L indol-3-asetik asit (IAA) içeren Linsmaier and Skoog (1965) besi ortamı, Digitalis davisina Heywood, D. cariensis Jaub. Et Spach em. Werner ve D. trojana Ivan türlerinde başarıyla optimize edilmiştir. D. lamarckii Ivan.'da ise büyüme düzenleyicilerinden benzil-amino-pürin (BA) ve naftalen-asetik-asit (NAA)'nın daha başarılı olduğu gözlenmiştir.Eksplant kaynağı olarak çoğunlukla filamingo gagası tipi eksplantları, kullanılan diğer hipokotil, yaprak veya kök eksplanlarına göre daha başarılı bulunmuştur. Sürgün rejenerasyonuna ek olarak bazı türlerde (D. cariensis ve D. lamarckii) kallus üretimi çeşitli konsantrasyonlarda BA ve/veya NAA içeren LS veya Murashige ve Skoog (1962) besi ortamlarında çalışılmıştır. Bunlardan sadece D. lamarckii'den elde edilen kalluslardan çoklu sürgün üretilebilmiştir. Çalışmalarımızda sürgün rejenerasyonu, türden türe değişmekle beraber, 6 veya 8 haftalık bir kültür sürecinde, eksplant başına 1 ila 9 arasında sürgün üretimi ile farklılıklar göstermiştir. Kardenolit analizleri çeşitli lokasyon ve vejetasyonlardan (tomurcuk, çiçeklenme veya olgun meyve) toplanan yaprak örnekleri ile beraber çesitli in vitro materyaller (yaprak, sürgün vs.) ince tabaka kromatografisi (İTK) ve ters faz yüksek performanslı sıvı kromatografisi (TF-YPSK) kullanılarak tamamlanmıştır. Bu analizlerden İTK analizleri, kardenolitlerin çeşitli biyotik ve/veya abiyotik faktörlere (fizyolojik yaş, farklı lokasyon ve vejetasyon dönemleri) bağlı olarak türler arasında parmak izine benzer sistematik ilişki sergilediğini göstermiştir. YPSK analizleri ile İTK de saptanan kardenolitler nicel olarak da tespit edilmiştir. Bu noktada glukogitorosit miktari, Anadolu'da yetişen endemik yüksükotlarında en sık rastlanan kardenolit olarak, bitkilerin büyüme ve gelişmesine; yetiştiği coğrafyaya veya doku kültürü ortamına eklenen büyüme düzenleyicilerine bağlı olarak farklılıklar göstermiştir.

Members of the genus Digitalis L. are medicinally and economically important plants as they contain cardiac glycosides that increase contractions of the heart and regulate heart rhythms. Several methods for high-frequency in vitro regeneration of endemic Digitalis species of Anatolia were established testing different types of basal medium and explants excised from in vitro germinated seedlings. Of those tested medium formulations, Linsmaier and Skoog (1965), supplemented with 0.5 mg/L thidiazuron (TDZ) and 0.25 mg/L indole-3-acetic acid (IAA), was selected mainly for the optimization of later tissue culture protocols of Digitalis davisina Heywood, D. cariensis Jaub. et Spach em. Werner and D. trojana Ivan. For D. lamarckii Ivan., benzyl-amino-purine (BA) and naphtylene-acetic-acid (NAA) were more productive in terms of shoot formation.As an explant source, flamingo-bill type (FBT) explants in general were more productive than other tested hypocotly, leaf or root explants. In addition to shoot regeneration, callus induction was employed in some species (D. cariensis and D. lamarckii) on LS or Murashige and Skoog medium (1962) containing various concentrations of BA and NAA. Callus cultures obtained from D. lamarckii only was able to produce multiple shoots. Regeneration frequency varied from species to species producing a range of 1 to 9 shoots per explant within 6 or 8 weeks of in vitro cultivation periods. Cardenolide profiles of leaf materials of endemic Anatolian Digitalis collected from different locations at various vegetation periods (budding, flowering or seed setting) and of tissue culture samples (leaf, complete shoots, etc.) produced in vitro were also investigated using two instrumental analysis; thin layer chromatography (TLC) and reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC). TLC analysis provides us new insights as a fingerprint pattern of the cardenolides depending on various biotic and/or abiotic factors (physiological ages, different locations or vegetation periods). HPLC analysis was substantiated in terms of quantitative analysis of cardenolides detected by TLC. In that, glucogitorosid content, a major cardenolide, found in our endemic species, was directly correlated with plant growth and development by means of exogenously added growth regulators or seasonal factors as well as the geography where they distributed.