Digitalis ferruginea subsp. ferruginea’ya ait 3?-HSD, P5?R1 ve P5?R2 Genlerinin Metabolik Mühendisliği: Transplastomik Nicotiana tabacum’da Metabolom ve Transgenik Arabidopsis thaliana’da Promotör Analizleri
Küçük Resim Yok
Tarih
2020
Dergi Başlığı
Dergi ISSN
Cilt Başlığı
Yayıncı
Erişim Hakkı
info:eu-repo/semantics/openAccess
Özet
Proje kapsamında tamamlandığımız çalışmalar, iki temel konu başlığı altında toplanabilir: (A) Kardiyak glikozit biyosentez genlerinin fonksiyonel analizleri; (1) kardiyak glikozitlerin sentezinden sorumlu üç anahtar genin (3?-HSD, P5?R1 ve P5?R2), Digitalis ferruginea L. subsp. ferruginea (yüksükotu) bitkisinden izole edilerek, tütün (Nicotiana tabacum) bitkisinin plastid genomuna aktarılması (transplastomik transformasyon), (2) kardiyak glikozitlerin miktarlarının üretilen bu transplastomik tütün bitkilerinde HPLC analizleri ile belirlenmesi, (3) NMR yardımıyla transplastomik tütün bitkilerinde metabolom analizlerinin yapılması, (4) farklı abiyotik stres koşulları altında transplastomik tütün bitkilerinin fizyolojik ve biyokimyasal tepkilerinin incelenmesi, (5) bu hedef genlere ait proteinlerin hücre içi lokalizasyonunun, yeşil floresan protein (GFP) geni yardımıyla, transgenik soğan zarı hücrelerinde gözlenmesi, ve (B) Kardiyak glikozit biyosentez genlerinin promotor analizleri; Agrobacterium tumefaciens aracılığı ile transforme edilen transgenik Arabidopsis bitkilerinde, farklı abiyotik stres uygulamalarının ardından, söz konusu bu hedef genlere ait promotorların izole edilmesi ve analizlerinin yapılması. Transplastomik tütün (Nicotiana tabacum) transformasyonu, hedef genlerin biyolistik yöntemle tütün plastomuna aktarılmıştır. Bunun için, standart moleküler klonlama yöntemleri kullanılarak, tekli veya ikili kardiyak glikozit biyosentez geni/genleri içeren plastomik vektörler hazırlanmıştır. Transplastomik transformasyonun teyidi ise, DNA ve protein düzeyinde, PCR çoğaltımı, Southern blot ve Western blot analizleri ile tamamlanmıştır. Genlerin hücre içi lokalizasyonları, GFP geninin biyolistik bombardıman yöntemiyle soğan zarı hücrelerine aktarılmasının ardından, konfokal mikroskop yardımıyla görüntülenmiştir. Transplastomik tütün bitkilerinin kardiyak glikozit tayinleri HPLC ile, metabolom analizleri ise NMR ile tamamlanmıştır. Ayrıca, farklı biyo/fizyo-kimyasal yöntemler takip edilerek, abiyotik stres faktörlerinin fizyolojik etkileri incelenmiştir. Promotorların fonksiyonel analizlerine yönelik olarak, GUS geni ile birleştirilmiş promotorları içerecek olan transgenik Arabidopsis thaliana bitkileri, Agrobacterium tumefaciens aracılığı ile ?floral dip? yönetmine göre elde edilmiş, ve farklı abiyotik stres koşulları ve bitki büyüme düzenleyicilerinin teşvik edici etkisi altında test edilmiştir. Fonksiyonel analizler ve stres tolerans testlerinin; sıcaklık, soğuk, yaralanma, tuz, ağır metal gibi farklı stres koşulları altında gen ifadesinin işleyişi ve bitki büyüme hormonlarının etkilerini ortaya koyacak yararlı bulgular üretmesi beklenmektedir. Ayrıca, bu bulguların, hem tıbbi ilaç geliştirme ve üretim araştırmalarına hem de abiyotik stres toleransı yüksek bitki çeşitleri geliştirmeye yönelik tarımsal araştırmalara katkı sağlayacağını ummaktayız. Diğer taraftan, transplastomik tütün bitkisinin yüksek miktarda kardenolit veya yeni (novel) metabolit/ler ürettiğinin teyit edilmesi ile, bu ürünlerin büyük ölçekli ticari üretimleri mümkün olabilecektir. Projenin bir diğer faydalı çıktısı da, transplastomik transformasyon teknolojisi, gen kaçışı riskini ortadan kaldırma potansiyeline sahip olduğu için, birçok yararlı uygulama alanı olan GDO teknolojisinin toplum nezdindeki var olan olumsuz algısının azaltılmasına katkı sağlayacaktır.
Açıklama
07.10.2020
Anahtar Kelimeler
A. thaliana, n. tabacum l., digitalis, p5?r2, p5?r1, 3?-hsd, plastid transformasyonu
